协作网分析测试论文-DNA在金表面的固定方法研究进展
时间：2007-8-2 7:36:29 作者：admin 点击：
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DNA在金表面的固定方法研究进展
高志贤 何永红
（军事医学科学院卫生学环境医学研究所 天津300050）
摘要：DNA在转换器表面的有效固定是构建DNA生物传感器的关键步骤。本文根据拟固定DNA探针的类型综述了DNA探针在金表面的固定方法，以及影响探针固定的主要因素。DNA探针固定方法主要是共价固定方法，固定液的pH和离子强度、固定探针类型和浓度等对固定效果均有影响。 关键词：DNA生物传感器 DNA 金表面 固定
The Progress of Study on Immobilization of DNA on Gold Surface
He Yong Hong, Ren Jie, Gao Zhi Xian, Chao Fu Huan
(Institute of Hygiene and Environment Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050) Abstract: The immobilization of DNA on transfer is the key point of making a DNA- biosensor. This paper give a review on the immobilization methods according to the type of DNA probes which be anchored on the gold surface and the main factors influence the immobilization. The immobilization by covalent bonds is the primary method, and the pH, ion strength, type and concentration of DNA probe can affect the effects of immobilization. Keywords: DNA biosensor, DNA, gold surface, immobilization
核酸是重要的生命物质，其保存和传递生物遗传信息的独特方式，即特定的碱基序列和碱基配对的原则，是体外研究核酸功能和核酸检测方法的基础。用脱氧核糖核酸（DNA）作为识别元件构建的DNA生物传感器，在核酸检测中可以排除对标记的需要，同时具有在液相中快速、实时测定的优势，适合发展成为一种定量测定的自动装置[1]。在DNA生物传感器的构建中，DNA探针在转换器表面的有效固定是传感器能够进行准确检测的前提。固定应该使DNA保持原有生物活性，不易脱落，并易于与靶物质接触。根据转换器的性质，运用不同的方法将DNA探针固定在其表面。本文主要综述近年来在金表面固定DNA探针的研究成果，根据拟固定的探针是否需要修饰及如何修饰，将固定方法进行分类综述。 1 修饰DNA探针的固定
随着生物化学合成技术的发展，目前可以通过商业途径购买到按要求修饰的合成寡核苷酸，修饰方式主要是在DNA的末端连接含硫化合物、生物素和氨基等，再通过这些基团将DNA探针固定在金表面。 1.1 含硫化合物修饰的DNA（HS-ssDNA或-SS-ssDNA）探针的固定 已知许多含硫的化合物，如硫醇和二硫化物等，能够通过Au-S之间很强的化学键合力（键能高达184KJ/mol）在金表面自组装形成薄而有序的单分子层[2]。这种自组装层紧密有序，具有较好的机械和化学稳定性[3]。含硫化合物修饰的单链DNA（ssDNA）在金表面的固定就是基于上述原理。最常用的修饰剂是含1个硫原子的化合物（如6-巯基己烷）[4,5,6]，也有含2个硫原子的化合物[7,8]。一般采用修饰探针直接处理金表面的方法固定，也有通过胶体金固定的方法，见示意图1。
1.1.1 探针直接处理金表面的固定方法
洁净的金表面用探针溶液直接处理，作用一段时间后除去未固定的探针，用其他巯基化合物（如巯基己醇）进行封闭，这样就将探针牢固地固定在金表面，可用于DNA杂交反应，固定原理见图1（a）。
Mannelli等[4]用这种方法将探针固定在石英晶体微天平（quartz crystal microbalance, QCM）金电极表面，研究用于检测转基因生物中特定基因片段的方法。结果显示，这种方法固定探针是成功的，在固定条件尚未优化的情况下，该方法的变异系数（CV）是15%。Wang等[9]用巯基修饰的肽核酸（peptide nucleic acids,PNA）处理QCM金表面，结果显示87%的金表面被PNA覆盖，重复性实验的CV为18%，显示固定具有较好的重复性。杂交实验具有很好的特异性，可以检测单个碱基的错配。Okahata等[7]用β-(羟乙基)二硫乙氧基修饰的探针处理QCM金表面，在处理过程中监测频率变化，当频率降低约100Hz时，终止固定过程。根据频率质量关系，计算出30%的金表面被探针覆盖。通过Au-S键的固定非常牢固，将电极浸泡在缓冲液中24h，难以将固定探针从QCM上除去[7]。 1.1.2 通过胶体金的固定方法
胶体金是一种纳米金颗粒，表面积大并具有良好的生物相容性，在构建DNA生物传感器中具有重要的作用。通过两端带有硫原子的双功能化合物可以将胶体金固定在金表面，探针通过Au-S键固定在胶体金上，这种方法较直接处理方法复杂，但胶体金具有较大的表面积，可以大大提高探针的固定量。
Lin等[10]通过1,6-己二硫醇在QCM金表面自组装形成外端为巯基的单分子层，胶体金与外端巯基结合，固定在金表面。在胶体金的固定过程中，可以观察到胶体金溶液的颜色从深红色变成无色，说明胶体金被有效地吸附到金表面。探针溶液与覆盖胶体金的金表面作用，通过自组装固定在胶体金颗粒上。实验显示，胶体金修饰的QCM上探针的吸附率和饱和吸附量均比裸金QCM大得多，固定探针的量随胶体金的增加而呈线性增加，因而可以通过控制胶体金的量来调整探针的固定量。杂交实验显示，在靶浓度一定的情况下，胶体金修饰的QCM的频率变化是不修饰的4倍，大大提高了检测灵敏度。他们比较了不同的含硫化合物，如胱胺、半胱胺和1,6-己二硫醇在金表面固定胶体金的能力，结果显示，1,6-己二硫醇具有明显的固定胶体金的能力，胱胺和半胱胺没有显示固定胶体金的能力，但原因尚不清楚。Cai等[5]的研究则显示，半胱胺修饰的金表面可以吸附胶体金颗粒。他们测定计算出裸金电极、半胱胺修饰电极和胶体金修饰电极的表面积分别为0.045cm2、
0.049cm2和0.11cm2，很明显，胶体金使金电极的有效面积增大了约2.5倍，大大增加了可以固定ssDNA的面积。比较同一探针在裸金电极和胶体金修饰电极上的吸附行为，在吸附开始的1小时，探针在胶体金修饰电极上的增加比在裸金电极上的增加快得多，显示在胶体金修饰电极上固定探针更容易，且探针在胶体金修饰电极上的饱和固定量是在裸金电极上的10倍，因此所构建的电化学DNA传感器的检测限，也提高了10倍，并有很好的特异性和重复性（CV=3.6%）。胶体金的应用使固定探针的表面积大大增加，增加的探针固定量使杂交容量大大提高，从而改善DNA生物传感器的灵敏度。 含硫化合物修饰的探针在金表面固定的原理明确，操作简单。但有人认为巯基化探针直接结合到金表面，DNA链之间会有强烈的相互作用，DNA可能在金表面以平躺的方式存在，不利于与溶液中互补DNA链杂交[11]。关于此类探针在金表面固定的确切形态，尚无直观的图象证据。 1.2生物素修饰的DNA（biotin-ssDNA）探针的固定
生物素分子易于活化，与核酸分子偶联率高且不影响核酸的生物活性，通过能与生物素特异性结合的亲和素或链亲和素（avidin or atreptavidin）作为桥梁，将DNA固定在金表面。用亲和素作为桥梁，首先要将亲和素固定在金表面，根据亲和素的固定方式不同，可以大致分为如下几类： 1.2.1亲和素固定在羧基修饰的金表面
在金表面修饰羧基，通过羧基与亲和素中的氨基反应形成酰胺键，将亲和素共价固定在金表面，再通过亲和素与生物素之间的相互作用，将biotin-ssDNA固定在金表面。
用3,3’- 二硫二丙酸（3,3’-dithiodipropronic acid, DDPA）处理QCM金电极，DDPA通过分子中的硫原子在金表面自组装形成外端为羧基的有序单分子层，通过共价偶联活化剂N-乙基-N’-(3-二甲胺丙基）碳二亚胺（N-ethyl-N’- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC）和琥珀酰亚胺（N-hydroxysuucinimide, NHS）活化羧基，使羧基与链亲和素分子中的氨基发生缩合反应，将链亲和素共价固定在金表面[7,12,13],固定过程见图2。固定探针的电极只在与互补DNA作用时有明显的频率变化，显示出很好的特异性。
Tombelli等[14]利用同样的原理在QCM金表面固定biotin-ssDNA，但他们的操作步骤较为复杂，首先用11-巯基十一醇处理金表面，羟基化表面用表氯醇处理后用碱性右旋糖苷溶液处理，最后用溴乙酸处理使表面修饰羧甲基基团，羧甲基用NHS和EDC活化后，与链亲和素作用，使链亲和素共价固定在金表面。
1.2.2 亲和素固定在生物素修饰金表面
在金表面预先吸附一层生物素分子，亲和素通过与生物素的结合固定在金表面。由于一个亲和素有4个生物素结合位点，因此结合的亲和素还可以与biotin-DNA结合，从而以一种生物素/亲和素/生物素的三明治式的方式将探针固定在金表面。
Kukanskis等[15]用生物素化蛋白质处理金表面，通过蛋白质在金表面的吸附将生物素固定。他们使用流动注射装置，使生物素化小牛血清白蛋白溶液、链亲和素溶液和biotin-ssDNA溶液依次流过金表面，从而形成生物素/亲和素/生物素的固定结构。这种固定方法简单，蛋白质虽然不是共价结合在金表面，但实验结果显示，蛋白质层可以稳定20h，在超过12 h的杂交过程中，分子的脱落是可以忽略的。Su[16]在QCM银表面滴加聚苯乙烯（polystyrene，PS）甲苯溶液，使表面形成均匀的、厚约0.8μm的PS薄膜，在此薄膜上滴加光生物素溶液，用紫外灯照射形成稳定的光生物素薄膜，用亲和素溶液处理后，与biotin-ssDNA溶液作用，待频率变化达到最大并稳定后，固定的探针即可用于杂交实验。他们用X-射线光电子能谱（XPS）对电极表面进行了分析，谱图显示电极表面光生物素化和随后的亲和素固定是成功的，这种在银表面固定亲和素的方法也可以用在金表面。
1.2.3 亲和素固定在负电聚合物修饰的金表面
亲和素的等电点为10.0-10.5，在中性环境中分子带正电，可以通过与带负电的物质之间的静电相互作用固定在负电聚合物修饰的金表面。Caruso等[12]用3-巯基丙酸处理QCM金表面，然后用聚丙胺盐酸盐（poly(allylamine hydrochloride)，PAH)处理，使表面形成带正电的聚合物薄膜，在此薄膜上沉积带负电的聚苯乙烯磺酸盐（poly(styrensulfonate), PSS），吸附带正电的亲和素，亲和素再吸附PSS，如此反复，在金表面形成一个4层PSS和5层亲和素的夹心多层膜。实验结果显示，这个多层膜固定的探针与靶DNA杂交的速度比单层慢，说明发生了靶DNA渗透进入膜内。杂交反应具有较好的特异性，且杂交引起的频率变化是单层膜的4-5倍，显示在靶DNA浓度一定时，构建多层探针可以提高检测灵敏度。
生物素与亲和素结合速度快，它们之间的非共价相互作用的亲和常数高达1015/mol，形成的复合物非常稳定，溶液pH的变化和一般的操作，如多次洗涤等，不会影响其稳定性[14]。生物素-亲和素系统的另一个优点是具有放大作用，一个亲和素可以连接4个生物素，有利于固定更多的探针，提高杂交容量，因此，在探针的固
定中，该系统受到广泛的重视。但这种固定方法需要对金表面进行多次处理，操作较为烦琐，且整个过程必须在液相中完成，因为亲和素一旦干燥，就会变性失去活性，丧失与生物素相互作用的能力。此外，这种方法的成本也相对偏高，对于应用推广可能有一定的影响。 1.3 氨基修饰的DNA（H2N-ssDNA）探针的固定
DNA探针通过末端修饰的氨基与金表面修饰的羧基或活泼酯基团反应形成酰胺键，共价固定在金表面。 Wrobel等[18]用16-巯基十六酸处理金表面，在金表面自组装形成致密有序的外端为羧基的单分子层。在共价偶联活化剂的作用下，探针的氨基与金表面的羧基反应形成酰胺键，从而将探针固定在金表面。Zhang等[19]用α-硫辛酸处理电化学石英晶体微天平（EQCM）金表面，通过连续监测频率变化，对硫辛酸在金表面的自组装过程进行了研究。结果显示，频率在开始时急速下降，在1.5h后趋于平缓，提示硫辛酸在金表面的自组装过程迅速，并在2h后吸附达到饱和。在此修饰电极表面滴加磷酸盐缓冲液，频率在5min左右稳定，显示自组装膜非常稳定。用循环伏安法对修饰金表面进行表征，也显示金表面形成了硫辛酸自组装单分子层，羧基在层的外面。经活化后的羧基与探针上的氨基反应形成酰胺键，将探针共价固定在金表面。与上述在金表面修饰羧基并进行活化的方法略有不同，Peng等[20]预先合成一个带有活泼酯基团的含硫化合物TAPD（N-[6-(thien-3-yl)acetoxyl]–pyrrolidine- 2,5-dione），TAPD在金表面上自组装形成单分子层，然后与探针作用，使探针共价固定在金表面，固定过程见图3。TAPD是一个导电的分子，在55℃和92℃均能保持电化学活性，意味着这个交联化合物在DNA杂交的温度变化范围内是稳 定的。通过TAPD在金表面固定H2N-ssDNA，整个过程只需要不到 40min，大大缩短了固定时间，简化了固定程序，具有一定的优势。 氨基修饰的DNA的固定方法操作简单，所需时间也较短，是一种较常用的方法。 2 不修饰DNA的固定
虽然修饰寡核苷酸可以购买到，但修饰使合成DNA的成本成倍增加，且目前的合成技术在合成长于50-mer修饰DNA方面仍有困难，并难以保证其质量。因此，对于不修饰DNA的固定方法的研究也是很有必要的。不修饰DNA可以通过形成共价键和物理吸附两种方式固定在金表面。 2.1 形成共价键的固定方式
在DNA的5’和3’端分别存在可以利用的磷酸基团和羟基基团，可以在金表面修饰能与这两种基团反应的功
能性基团，如羧基、氨基、羟基等，通过化学反应将DNA共价固定在金表面[21]，固定的原理见图4。 2.1.1 DNA探针固定在羟基修饰的金表面
赵元弟等[22]用2-巯基乙醇处理金表面，通过巯基在金表面自组装形成外端为羟基的单分子层，在EDC存在下，dsDNA（或ssDNA）通过5’端经EDC活化的磷酸基团与羟基反应生成磷酯键而固定在金表面上。他们用电化学方法和XPS对DNA修饰表面进行表征，结果显示，在共价偶联活化剂作用下，DNA探针确实被共价固定到金表面。他们提醒，整个过程应在液相中进行，以保证界面反应顺利，尽量降低因表面干燥而使DNA在表面非特异性吸附的可能性。
2.1.2 DNA固定在羧基修饰的金表面
Ye等[23]用PCR扩增一段特异的乙型肝炎病毒（HBV）的DNA片段（181bp），分离纯化后，通过100℃水浴加热5min，立即放入冰水中冷却的方法制备用于固定的ssDNA探针。探针固定前，先用巯基乙酸处理金表面，在金表面形成外端带有羧基的自组装单分子层，在EDC作用下，通过探针3’端的羟基与金表面的羧基缩合形成酯键，将探针共价固定在金表面。 2.1.3 DNA探针固定在氨基修饰的金表面
Zhang等[24]用二硫双十二酰胺（didodecyl dithiono-oxamide，DDDTO）处理QCM银电极，在其表面形成自组装单分子层，利用牛血清白蛋白（BSA）可以牢固吸附在硫醇单层上的特点，将BSA固定在修饰银表面，然后与探针溶液作用，利用BSA中富含的氨基与DNA5’端的磷酸基团反应形成磷酰胺键，将探针共价固定在电极表面。通过加热变性使固定的dsDNA转变成ssDNA，这种方法也可以用于金表面固定DNA。阻抗分析结果显示，dsDNA在DDDTO-BSA修饰的电极表面固定的量远远高于在裸电极和DDDTO修饰的电极表面固定的量，因为BSA具有较大的表面积和丰富的固定DNA的活性位点。Zhou等[25]利用同样的原理，用酪蛋白处理QCM金表面，在共价偶联活化剂EDC作用下，将DNA固定到金表面。 2.1.4 DNA探针固定在醛基修饰的金表面
戊二醛是一个双功能试剂，通常被用作带氨基的化合物，如蛋白质和核酸的交联剂。Zhou等[25]在QCM金表面滴加聚乙烯亚胺溶液，使其均匀分布，干燥后用戊二醛处理，戊二醛的一个醛基与聚乙烯亚胺分子中的氨基反应，形成席夫碱，另一个醛基游离，与dsDNA上的氨基反应，形成另一个席夫碱结构，从而将dsDNA
共价固定在金表面。固定的双链DNA在85℃处理10min，然后迅速置于冰水中，使其变成单链。这样构建的QCM DNA生物传感器可成功的用于检测互补DNA，具有较好的特异性，可以重复使用5次。
辉光放电技术是常用的物质表面处理技术，可以改变物质的表面特性而不损伤其整体结构，并可以在物质表面修饰各种不同的功能基团，如羧基、羟基和氨基等。Duman等[26]用等离子辉光放电技术在QCM金表面形成聚乙烯二胺等离子体膜，使金表面修饰氨基，戊二醛处理后，利用与上述同样的原理将DNA共价固定在金表面。他们所用于固定的DNA与众不同，即与互补序列比较，欲固定的ssDNA在5’端多一个核苷，当两条链完全杂交后，双链在其5’端有一个自由的碱基，意味着dsDNA通过这个碱基共价结合到金表面上，这就保证了DNA固定的方向性。该研究中，辉光放电形成的聚乙烯二胺等离子体膜的厚度为4.3±2.4nm，对QCM的敏感性和响应时间没有影响，将构建的DNA传感器用于杂交实验，显示杂交可以在5min左右达到平衡。 2.1.5 DNA探针固定在硅烷化金表面
硅烷化处理也是改变物质表面性质的一个常用手段。用含氧硅烷试剂处理金表面，硅烷化合物以Au-O-Si键在金表面形成自组装单分子层，其中含氧基团水解后，使金表面带上更多的羟基，与DNA中的磷酸基团反应形成磷酯键，从而将DNA共价固定在金表面。
Yamaguchi等[27]用3-甘氨环氧丙基-三甲氧基硅烷(3-glycidoxy propyl-trimethoxysilane, GPTMS)蒸汽处理QCM金表面，然后用水冲洗表面使吸附的GPTMS分子中的环氧基和甲氧基水解，水解使金表面上带上更多的羟基，用纯化的λ-噬菌体DNA（约4900个碱基）作为探针，修饰QCM金表面与探针作用过程中，频率明显降低，说明探针已经固定到金表面上，固定的dsDNA通过90-95℃加热5min解链形成ssDNA，可用于检测靶DNA。
陈誉华等[28]采用在碱性溶液中电解的方法使QCM金表面氧化，然后用3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropvltriethoxy-silane,γ-ATPES)处理，室温干燥后，将硅烷化金电极放入微型电泳槽中作为阳极，通过电泳的方法使欲固定的单纯疱疹病毒（herpes simplex virus,HSV）等的PCR扩增片段富集在金电极表面，紫外光照射将dsDNA交联固定。以此方法制备的DNA QCM生物传感器显示很好的特异性。 2.1.6 DNA探针在金表面的物理吸附
通过物理吸附的方法使DNA固定在金表面，是所有方法中最简单的一种。Zhao等[29]将清洁的金表面直接用
小牛胸腺DNA溶液处理，然后浸入水中除去未结合的dsDNA，就得到了dsDNA修饰的电极。固定ssDNA的方法相同，只是固定时间比dsDNA长4倍，且需在低温下处理。用循环伏安法对修饰电极进行表征，结果显示，dsDNA和ssDNA均成功的固定在金表面，dsDNA和ssDNA在金表面的固定密度相近，都是一种饱和吸附的单层。他们将两支dsDNA修饰电极分别用0.05mol/L H2SO4和0.1mol/L NaOH处理，结果显示，电极在酸中稳定，而在碱性环境中固定的DNA解吸附，电极的修饰层受到破坏。用沸水处理，绝大部分固定在电极表面的dsDNA和ssDNA脱落，说明修饰层对热不稳定。在电化学测定中，高电位可以使约2/3的ssDNA从电极上脱落，即修饰层在高电位不稳定，但电极在干燥环境中放置较长时间，对其电化学活性没有影响。Yan等[30]和Wang等[31]以相似的方法分别在金表面固定了合成的ssDNA和小牛胸腺DNA。
物理吸附固定方法简单，但其固定的原理和DNA在金表面的状态并不清楚，从其稳定性看，是非共价固定，因此固定探针与互补序列的杂交反应特性尚需研究。 3 影响DNA在金表面固定的因素
DNA生物传感器的质量与DNA探针在传感器上的固定密切相关。许多因素会影响到DNA的固定效果，如固定液的pH值和离子强度，拟固定探针长度和浓度，固定时间等。 3.1 固定液pH值的影响
Wrobel等[18]对氨基修饰DNA探针进行放射性标记，直接研究了影响氨基修饰探针在羧基修饰金表面固定的因素。固定离子强度（0.5mmol/L磷酸盐缓冲液），变化pH的实验结果显示，当pH从酸性（pH 2.2）上升到中性（pH 6.9）时，DNA在金表面的非共价吸附量降低约2.5倍，但pH继续升高（pH 9.4），吸附量没有明显变化。
Ito等[1]研究了固定液的pH对巯基修饰DNA在金表面固定的影响，结果显示，在酸性环境中（pH 3.0）探针的固定量最大，在中性环境中（pH 7.0）中固定量最少，在碱性环境中（pH 10.0）的固定量介于二者之间。他们分析这种现象与静电作用有关。有报道腺苷的pKa值为3.52，因此在酸性环境中质子化，同时金表面的zate电位是负值，因此，DNA不仅通过特定的Au-S化学吸附，也通过静电吸附固定在金表面。因为硫醇残基的PkSH通常都低于10，因此在碱性环境中，DNA上修饰的硫醇残基可能质子化，从而加强了探针的吸附。在中性环境中，核酸以多价负离子形式存在，很难通过静电吸附，而只能通过Au-S键固定在金表面，因而固
定量是最少的。 从以上研究可以看出，偏酸性的环境有利于探针在金表面的固定，而中性条件下固定的探针杂交能力最强，因此，绝大多数研究者选择在中性左右的环境中固定探针，见表1。 3.2 固定液离子强度的影响 Wrobel等[18]固定pH，研究离子强度对氨基修饰DNA在羧基修饰金表面物理吸附的影响，结果显示，1mol/LKCl中DNA在金表面的吸附量是10mmol/LKCl中的约2倍，因为离子强度的增加削弱静电相互作用，因此有较高的DNA吸附。但在共价固定中，与较低离子强度（10mmol/LKCl）固定液比较，通常推荐使用的高离子强度的固定液（1mol/LKCl）只对固定有很小的改善作用。 离子强度的增加有利于探针的固定，大多数研究者所用的离子强度在0.01-1之间，见表1。 3.3 固定DNA探针长度的影响 Cai等[5]的研究显示，对于同一种DNA（修饰或不修饰）探针，DNA固定量随长度的增加而减小，这可能是因为短探针倾向于从末端固定，而长探针可能以链上多点固定在电极表面，使一个DNA链在金表面占有的面积不同，产生差异。 Table 1. The immobilization of DNA probe on gold surface 探针类型 金表面修饰类型 Modif. type of gold urface PH 离子强度 检测限 Type of DNA probe Ion strength Detect limit 检测范围 参考文Detect range 献 Ref.
HS-ssDNA HS-ssDNA HS-ssDNA HS-ssDNA -SS-ssDNA) HS-ssDNA Colloid Au 3.8 1.0 mol L-1KH2PO4 7.5 0.1 mol L-1phosphate buffer 7.0 0.02 mol L-1 Na2HPO4 0.35-40ug/ml 0.12-1.0u mol L-1 4 1 9 2 8 10 4 15 7.9 10mmol L-1 Tris-HCl+0.2 0.01u mol L-1 mol L-1 NaCl 6.7 1.0 mol L-1potassium phosphate buffer 5.0 10mmol L-1 acetate buffer 7.4 300mmol L-1 NaCl+ 20mmol L-1 Na2HPO4+0.1mmol L-1 EDTA 7.4 300mmol L-1NaCl+ 20mmol L-1Na2HPO4+0.1mmol L-1EDTA 7.4 300mmol L-1NaCl+ 20mmol L-1 Na2HPO4+0.1m mol L-1EDTA 7.5 0.05 mol L-1HEPES buffer 7.5 0.05 mol L-1HEPES buffer 7.0 0.1 mol L-1 phosphate buffer 0.35ug/ml biotin-ssDNA Atreptavidin biotin-ssDNA Atreptavidin biotin-ssDNA Atreptavidin 0.25-1.0u mol L-1 15 biotin-ssDNA Atreptavidin 0.1-1.0u mol L-1 15 biotin-ssDNA biotin-ssDNA biotin-ssDNA biotin-ssDNA Avdin Avdin Avdin Avdin 13 7 2 17 7.9 10mmol L-1Tris-HCl+0.2 0.01u mol L-1 mol L-1 NaCl。 7.4 0.01mol L-1phosphate buffer+0.15 mol L-1 NaCl， H2N-ssDNA TAPD 7.4 0.1 mol L-1phosphate buffer 5×10-8 mol L-1 21 27 19 20 8 DsDNA Aldelyde groups 9.2 0.1 mol L-1carbonate buffer H2N-ssDNA Carboxyl group 4.0 0.4mmol L-1phosphate buffer H2N-ssDNA Carboxyl group 7.0 1/15mol L-1sodium 2.0×10-12 phosphate buffer mol L-1 Calf thymus Amido groups 7.1 5mmol L-1 NaCl+ 5m mol DNA L-1 Tris-HCl ssDNA ssDNA Amido groups 6.0 0.1mol L-1EDC+0.1mol L-1 30pg/ml 0.1ng/ml-0.1ug/ml 34 N-methylimidazole buffer 8.0 1mmol L-1Tris-HCl+ 1mmol 9.0×10-11 mol 1.8×10-10-9.0×10-8 L-1EDTA L-1 mol L-1 31 3.4 固定DNA探针浓度的影响 刘明华等[32]的研究显示，金表面巯基修饰DNA探针的固定量随DNA浓度的增加而增加，杂交量也增加，杂交时间缩短。但当DNA探针达到一定浓度后，杂交量反而降低，这可能与DNA的空间排列结构和DNA分子间的静电排斥有关。Zhou等[25] 和Yamaguchi等[27]的研究也显示，随着探针浓度的增加，固定量增加，但浓度达到一定后，会出现饱和吸附，即固定探针量不再增加。 3.4 固定时间的影响 DNA探针在金表面的固定量随着作用时间的延长而迅速增加，但一定时间后，固定量的增加减慢，最后达到饱和。不同的固定方法，达到饱和的时间不同，快者几十分钟[25]，慢者数小时[26]。 3.5 共价偶联活化剂的作用 由于化学反应的原因，如果没有共价偶联活化剂的作用，在室温水溶液中氨基和羧基、羟基和羧基、羟基和磷酸基团的缩合反应是不能进行的。常用的共价偶联活化剂是碳二亚胺（EDC）和琥珀酰亚胺（NHS）。一般同时使用EDC和NHS，但Wrobel等[18]的研究显示，同时存在EDC和NHS时DNA的固定量并不比EDC单独存在时多。Ge等[34]认为EDC和NHS应该用磷酸盐缓冲液配制，而不是Tris-HCl缓冲液。 4 DNA探针固定方法比较
Okahata等[7]比较了生物素修饰DNA探针和含硫化合物修饰DNA探针在金表面的固定效果，结果显示，两种方法固定的探针量、与靶DNA杂交的量相似，都能分辨一个碱基的错配，但前者杂交反应迅速，约40min达到杂交平衡，而后者需4h才能达到杂交平衡。动力学研究表明，后者的DNA结合和解离的速度均大大低于前者，原因是在两种固定方法中，空间位阻的影响不同。DNA（～3nm）通过较长的亲和素分子（～5nm）间隔臂固定，与通过较短的含硫基团（～0.4nm）间隔臂固定比较，后者与靶DNA结合的空间位阻明显较大，表现为DNA结合和解离常数降低，从而降低杂交平衡常数，使杂交速率减慢，从杂交速率看，认为亲和素-生物素固定法较好。陈鸣等[5]的研究也得出了相似的结论。
Tombelli等[14]比较了固定生物素修饰DNA探针的三种方法，即分别用硫醇和右旋糖苷、11-巯基十一酸及11-巯基十一酸和辛硫醇混合物处理金表面，然后固定生物素修饰的DNA。结果显示，第一种固定方法的特异性和灵敏度最好，变异系数最小，可以再生使用15-20次，放4℃可以保存数周而不丧失活性。虽然该法固定时间长，操作复杂，但他们仍然推荐使用这种方法，并在他们的实验室中沿用此法[4]
不同的固定方法各有优势，固定的效果也有所差异，由于目前尚无一致的评价标准，不同实验室和研究者之间的方法难以进行简单的比较。 5 结语
从以上的综述中可以看出，DNA探针在金表面的固定方法多种多样。从保持DNA完整的生物活性（包括杂交活性和生物亲和性）来看，较好的固定方法应该是共价偶联方法，DNA链通过其一端固定在金表面，另一端游离在表面之上，有利于与靶DNA的杂交。通过物理吸附的方式在金表面固定DNA，操作简单，这样获得的电极可用于研究DNA和其他分子之间的相互作用，但不适合构建DNA生物传感器[21]。发展简单而不影响DNA生物活性的高效的DNA固定方法仍然是DNA生物传感器研究中的重点。
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