发酵工程工艺原理实验报告
小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化
指标测定
学 校： 华南农业大学 学 院： 食品学院
班 级： XX级食品科学与工程X班
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小型发酵罐的使用及发酵过程中主要生化指标测定
摘要 为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况，本实验以
分批培养法培养大肠杆菌，通过控制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等参数，并每小时取样测DO值和还原糖量，制作菌体生长曲线，以此判断大肠杆菌的生长发酵状况。本实验选用生长迅速的大肠杆菌进行发酵罐的培养，同时定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的细菌浊度以及残留还原糖的变化。
关键词 大肠杆菌 发酵
前言 发酵过程中，微生物的生长呈一定规律，掌握微生物生长曲线，可以防
止菌种老化衰退、防止有害产物积累、提高发酵的效率，对生产有指导意义。通过测定生化指标，可大体了解菌体生长曲线，并在此基础上采取适当措施促进微生物生长。生长曲线中，微生物产生代谢产物或抗生素多在对数期末期或稳定期，因此可采取方法延长次期，如通过发酵罐等方法，不断调节培养基的pH值，去除有害物质，增加适量的气体和营养物质，使微生物延迟进入或不进入衰退期，从而生产出大量的有用的代谢产物。发酵罐是生化、食品、医药、农药、化工等生产领域的常用设备，虽然发酵罐的类型很多,如自吸式、气升式等。但发酵工厂用得最多的还是传统的通用发酵罐(机械搅拌发酵罐)[2]。发酵罐配备控制系统，它主要是对发酵过程中的各种参数如温度、pH、溶解氧、搅拌速度、空气流量、补料、泡沫水平等进行设定、显示、记录以及对这些参数进行反馈调节控制。
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1材料与方法
1.1实验流程：
菌种斜面培养24h培养12h一级种子37℃（250mL摇瓶)37℃培养基 发酵罐管路准备 实罐灭菌发酵8～10h放罐37℃取样分析测定
培养10h二级种子(500mL摇瓶）37℃
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1.2菌种准备 1.2.1配制培养基
1) 配制种子固体培养基100mL，分装试管，0.1MPa灭菌20min，然后摆成斜面。
2) 配制种子培养液600mL，分装50mL于一个250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下550mL平均分装于三个500mL三角瓶中（作二级种子用），同上灭菌。 1.2.2接种与培养
1) 上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37℃培养24h。
2) 上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶， 37℃振荡培养12h，然后转接二级种子瓶， 37℃振荡培养10h。 1.3上罐前的准备及实罐灭菌
1) 洗净发酵罐及各联接胶管
2) 配制发酵培养基5.0L，置发酵罐内，加入几滴泡敌。 3) 校正pH电极和溶氧（DO）电极。
4) 把电极插口、取样管、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套出、进水阀V2、W1，使夹套充满水，用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启动蒸气发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min，开启冷凝水出水阀V1，开启蒸气阀门S1，进行在位灭菌。 5) 当保护罩顶部阀门V4有蒸气排出时，2min后关闭阀门，当罐温接近灭菌温度时，微开阀V4适当排气，并调整蒸气阀S1维持罐温。保温结束后，关蒸气阀S1，全开冷凝水出水阀V1，开进水阀W3，将温度设定在37℃，切入自动。
6) 当温度降到100℃以下，缓缓开排气阀V4，使保护罩顶压力表指示为零，移去保护罩。
7) 连接通气管路，将进气过滤器K7口与控制台左侧空气出口连通，开弹簧夹，接通空气压缩机电源，对发酵罐进行通气，调整空气流量3～5L/min。 8) 当温度达到37℃时，将预先灭菌的pH电极、DO电极（75%酒精消毒、UV消毒）接入发酵罐，连接各电极导线。
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9) 将流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设在15%，下限设为“0”，待一切准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。
10) 设定搅拌转速为300r/min、空气流量2～3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入发酵状态。 1.4发酵操作
1) 当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，进行如下操作：
2) 取样：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶，开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3。
3) 接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口，点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。 1.5发酵过程中的管理
1) 每小时记录发酵过程温度、pH、DO、通风、转速的测定数值，并记录操作情况。
2) 注意发酵罐运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇有故障及时排除。(例：当在某一时段泡沫大量生成时，系统消泡不运转，可将消泡泵切入到手动加入几滴消泡剂)。
3) 每小时取一次样。每次取样50mL。取样时，用量筒准确取流出的培养液50mL, 对号倒入三角瓶中，封口，立即放入冰箱保存。 1.6放罐
经过发酵约10h后，菌量增长（OD）值缓慢时，便可放罐。排放液需经灭菌处理才可进入下水道。 1.7清洗
放罐后，将发酵罐清洗干净，关闭所有电源。
2结果与分析
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2.1 pH随时间变化的规律
图1 不同时间发酵液的pH值
由图1可知，发酵过程中pH值的总趋势是先缓慢下降，待下降到最低值后，再开始迅速上升然后趋于平缓。0～2h延滞期的菌体生长缓慢，pH值略有下降，是因为菌体在繁殖时消耗弱碱性的葡萄糖导致pH值下降，由于菌体数量较少，其下降幅度较小；2～5h对数期菌体的比生长速率较高，消耗大量弱碱性的葡萄糖，导致pH值持续下降至最低值；5～7h稳定期的菌体数量保持不变， pH值呈现以上升速率逐渐增大的趋势上升，且整个上升阶段上升速率在稳定期末期达到最大上升速率，原因是菌体基数较大，大量的代谢产物积累，并产生碱性物质中和原有环境的酸度，导致pH值迅速上升；7～8h为发酵的衰亡期，pH值上升速率相比稳定期有所下降，并逐渐趋于平缓，原因是细胞开始衰亡，细胞代谢进入迟缓阶段，难以产生更多的代谢物质。
2.2 DO值随时间变化的规律
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