两步骤DNA建库测序方法
第一轮PCR反应，计算每个样品的基因组DNA的量，从而达到整个文库300倍的覆盖率，这样，一个样品需要用到200ug的的DNA(106个细胞产生6.6ug的DNA)。对于每一个样品，用6-8ug的基因组DNA进行25-30个独立的100ul体系的PCR反应，之后，把PCR产胡合并在一个15ml的离心管里面（~2.5-3ml）。
第一轮PCR反应的引物名称为：
lentiCRIPR_F1 lentiCRISPR_RV2
反应体系如下：
Component 100 μL STEP Initial Denaturation TEMP TIME Reaction 5X Q5 Reaction Buffer 10 mMdNTPs 10 μM Forward Primer 10 μM Reverse Primer Template DNA Q5 High-Fidelity DNA Polymerase Nuclease-Free Water 20 μL 2 μL 2 μL 98°C 30 seconds 98°C 16 Cycles 68°C 72°C 15 seconds 25 seconds 25 seconds 2 minutes 2 μL variable Final Extension 1 μL Hold to 100 μL 4°C 72°C
第二轮PCR反应中需要将Illumina的接头连接到样品上面，并且加上标签。第二轮PCR从第一轮PCR反应中取出2 ul作为模板，在100ul的体系中进行反应。
a. 第二轮PCR反应的引物包括了用于增加文库复杂性的可变序列和一个6个碱基的DNA序列。
b. PCR反应条件和第一轮PCR反应相同，但需要把循环数减少到8-12个。
用2%的琼脂糖凝胶电泳和凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物。为了达到测序需要的DNA的量，需要用到第二轮PCR反应中的50ul的PCR产物。
