（6）以300目尼龙网滤去细胞团块；
（7）细胞用固定液固定或低温保存备用。
2、网搓法
（1）将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；
（2）把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；
（3）收集细胞悬液，500-800 rpm离心沉淀2min；
（4）固定细胞或低温保存备用。
3、研磨法
（1）先将组织剪成1-2 mm3大小组织块；
（2）放入组织研磨器中加入1-2 ml生理盐水；
（3）转动研棒，研至匀浆；
（4）加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；
（5）收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 rpm，1-2 min，再以生理盐水洗3 遍，离心沉淀；
（6）固定或低温保存细胞悬液，备用。
（三）化学处理法
1、作用原理
化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。
2、试剂的配制
（1） 0.2%EDTA配制：称EDTA 0.2g，加入Hankˊs液100ml，封装高压消毒。置0℃-4℃保存；
（2）胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（pH7.0）200ml，浓度0.125%，EDTA 0.2g 加PBS（pH7.0）100ml，浓度0.2%。各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可使用。
3、实验方法
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（1）将组织切成薄片，置入试管中；
（2）首先加入EDTA液5ml，室温下0.5h，离心弃之；
（3）再加入胰酶-EDTA液5ml。在37℃恒温水浴振荡器内30min；
（4）用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000 rpm，5min。再以生理盐水洗2-3次；
（5）细胞固定或低温保存备用。
以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。实验证明，用化学试剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳定；化学试剂可单独使用，也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。所以要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的FCM检测结果。
（四）注意事项
1、新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织
坏死以及细胞自溶，影响FCM测定结果；
2、根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的
不稳定；
3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方
面对酶消化法的影响。
4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞
瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；
往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；
5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺
癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好，因为胶原酶具有在Ca2+、Mg2+存在或在血清状态下不发生活性降低的特性。
二、组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备
正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及内窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少，制备起来比较麻烦。但其制备方法与实体组织基本相似。
1、取材后立即放入盛少许PBS液青霉素小瓶中；
2、另取一只小烧杯，杯口用300目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用PBS液湿润；取新
鲜组织标本置尼龙网上；因标本量较少，尤其是内窥镜取材只少要取3块以上；
3、在操作前，先将剪刀用PBS液浸润一下，然后开始剪碎组织；
4、先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS液，冲洗细
胞均浆并过滤于小烧杯中；如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该PBS 液冲洗，直至网上无组织块为止。这样可尽量多的收集细胞；
5、细胞加固定液或低温保存，备用。
三、石蜡包埋组织样本的制备
石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用范围。对大量临床随访资料通过病理包埋组织的流式细胞术分析，可以重新得到深入研究和利用。现将常用的石蜡包埋组织制备单细胞方法介绍如下。
1、实验方法：
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（1）把石蜡包埋组织切成40-50um厚的组织片3-5片，或用乳钵研成0.5mm直径大小颗粒状，放入10ml的试管中；
（2）加入二甲苯5-8ml, 在室温下脱蜡1-2 天，视石蜡脱净与否，更换1-2 次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；
（3）水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步为10 min，去乙醇，加入蒸馏水3-5 ml，10 min 后弃之；
（4）消化：加入2 ml 0.5% 胰蛋白酶（pH 1.5-2.0）消化液，置37℃恒温水浴中消化30 min，在消化期间，每隔10min 用振荡器振荡1次；
（5）消化30 min 后，立即加生理盐水终止消化；
（6）经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第2次消化；
（7）收集细胞悬液，离心沉淀1500 rpm ,再以生理盐水漂洗1-2 次，离心沉淀500-800 rpm 去碎片；
（8）保存细胞备用。
2、注意事项
（1）一定将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第1遍应在12小时左右，第2遍为30min左右。检测是否将石蜡已脱净的方法:是弃去二甲苯，加入无水乙醇，如果无絮状物浮起，即可视为蜡已脱净；反，则蜡尚未脱净；
（2） 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化；
（3） 切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。（4）消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min，37℃，然后用尖吸管吹打成悬液状；
（5）消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在300目尼龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用PBS液冲洗一下；如此反复，就能得到较多的单细胞悬液。
四、外周血单个核细胞样本的制备
血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血细胞在生理状态下呈分散的游离状态。它是流式细胞分析的理想样品。血液中的主要细胞成分为白细胞、红细胞和血小板；而其中白细胞主要成分又分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。但在血细胞中一般检测单个核细胞较为多见。
1、外周血细胞样本制备方法的选择
一般检测细胞大分子成分——DNA、RNA、蛋白质含量、基因表达蛋白等，多采用淋巴细胞分离液分离法制备单个核细胞悬液。这样可以从血液中分离出单个核细胞——淋巴细胞、单核细胞、幼稚血细胞和肿瘤细胞等。外周血免疫细胞、细胞因子、某些基因蛋白、细胞表面标志检测可采用溶红细胞法。
2、单个核细胞样品制备程序
（1）取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4 ml ,混匀；
（2）将稀释后血液沿试管壁徐徐加入4ml淋巴细胞分离液到液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态；
（3）离心2000rpm,30min,室温18-20℃，离心后可见试管内的血液清楚的分为4 层，上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间），底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层；
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（4）用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出收集到另1 试管中，用生理盐水洗2 遍，每次均以1500 rpm ,10 min ,弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液；
（5） 用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。
五、骨髓细胞单细胞悬液的制备
1、制备方法
（1）无菌抽取骨髓液0.5 ml；
（2）将骨髓标本滴入1000u/ml肝素抗凝的1 ml PBS液中；
（3）再加入PBS液稀释至10ml；
（4）用吸管吸取5 ml 稀释骨髓液徐徐加入盛有4 ml 的人类淋巴细胞分离液液面之上；（5）在以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上；（6）吸取有核细胞层，加入到10 ml PBS液中，混匀；
（7）以1000 rpm 离心 5 min ，弃上清；收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。
2、注意事项
（1）抽骨髓液时，先将注射器针头、针筒、针栓用肝素浸润，抽取时力量适中；
（2）在吸取淋巴细胞层时尽量少吸分离液，量应掌握在300 ul 左右，这样有利于洗去多余的分层液；
（3） 溶红细胞的方法：以等量的蒸馏水加入到沉淀中，轻轻摇动片刻，见粉红色出现，立即加入大量生理盐水，混匀，离心，去除上清即可。
六、培养细胞的单细胞悬液的制备
1、培养细胞的特征
一般细胞培养分为悬浮培养和贴壁培养，由于细胞的增殖，都有可能形成大小不等的细胞团块或连接成片。如果两个或多个细胞粘连在一块或细胞碎片过多都将影响FCM结果，进而导致实验失败。所以，制备合格的培养细胞单细胞悬液十分重要。
2、培养细胞样品的制备程序：
（1）将培养细胞用0.04%乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA2Na）或0.29%胰酶消化3-7min，（根据室温情况而定），至光镜下见到贴壁细胞间出现筛状间隙为止），弃去消化液，加PBS液；
（2）用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中；
（3）短时低速离心，即800-1000 rpm，5 min；
（4）弃上清，加pH 7.4的PBS液5-8ml，低速短时离心，800-1000prm，3-5 min ；重复2- 3次，以去除细胞悬液中的细胞碎片；
（5）加少许PBS液，将沉淀细胞轻轻吹打均匀。加固定液或低温保存待用。
七、脱落细胞样品单细胞悬液的制备
在临床工作中，可以收集到大量自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单处理，便可成为较好的单细胞悬液，提供流式细胞术分析。主要包括脱落细胞、胸腹水细胞、尿液、内镜刷检细胞等。
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1、食管拉网细胞的单细胞悬液的制备
(1) 将食管拉网器上的细胞洗脱到20 ml PBS液中，以1500 rpm 离心后，再用PBS液洗
2次，离心500-800 rpm, 1-2 min，弃上清；
(2) 再加入PBS液5 ml ，以300目尼龙滤网过滤，离心沉淀去上清；
(3)加少许PBS液混匀沉淀细胞，加固定液或低温保存，备用。
