APC-Cy 633nm 767nm
(以上二种染料可在装有双激光的流式胞仪上使用。如Coulter,Altra 或BD Calibur 或Partec Cyflow ML 或Cytomation, Moflow)
以上列出了各荧光素的激发及发射波长的峰值，但实际上各荧光素的激发或发射波长是正态或偏态曲线，即有很宽的范围。如下图，为FTIC ，PE 的发射波长，可以看到两者的发射波长均为偏态分布，FITC 受激后多数将光源转变为525nm 左右的光；PE 多数将其转变为575nm 左右的光。故在流式细胞仪中对FITC 检测525nm 附近的光，对PE 则检测
575nm
11左右的光。如果此时同时使用两种荧光染料，就会出现发射光谱相互叠加的现象。
图1-2-13 受激光照射后FITC 和PE 分子发射光谱互相干扰图
根据上图中FITC 和PE 发射波长的叠加情况，在流式细胞仪检测光信号时，PE 荧光探测器便会误检由FITC 发射的575左右波长的光；此时计算机会将此部分信号计入PE 荧光信号中，从而引起错误。同样PE 受激后也会发出小部分525nm 左右的光，进入FITC 荧光探测器中。此时就需要进行一系列仪器设置，人为地去除该部分干扰。
现在商业提供的荧光直标抗体上所结合的FITC 、PE 等荧光分子性状十分相近，其发射光的光谱分布也十分稳定。通过一系列调节，可以推算出漏入其他荧光探测器的信号占本探测器信号的百分比；一但设定该值，计算机会在其他探测器中减去根据本探测器的信号乘以百分比后的数值。如图：
图1-2-14 FITC 无PE 荧光检测补偿调节示意图
图1-2-15 PE 无FITC 荧光检测补偿调节示意图
其他荧光的补偿调节原理也同上图，如做FITC、PE、PE-Cy5三色荧光分析原则上需要调节的补偿有：FITC-%PE，PE-%FITC，PE-Cy5-%FITC，PE-Cy5-%PE，FITC-% PE-Cy5，
PE-% PE-Cy5六组补偿，即有23种组合。
由于在进行补偿之前的信号都已经过放大电路处理，所以525nm或其他波长的光信号可被转化为任何强度的电信号。同时又因为补偿电路在放大电路的后面，故补偿过程中的百分比数值将由两个部分决定：原荧光探测器的信号与漏进其他探测器的信号。补偿最终要达到的效果是：漏进其他探测器的信号-原荧光探测器的信号x N%=0。由此补偿的百分比数值将随着各灾光探测器的放大倍数（电压）变化而变化。特定电压对应于特定的补偿参数。
要确定补偿中百分比数值，需运用以上调节补偿的基本原理并结合特定的标本来实现。如现进行FITC、PE双色分析，先准备该试剂的阴性对照管：
A：IgGFITC/IgGPE，通过调节电压，使阴性群体落在FTIC及PE双阴性区。（注：在进行调补偿时，必须将原补偿全部归零）
图1-2-16 PE和FITC分子的阴性对照
阴性对照在此处的作用是调节各荧光探测器合适的放大倍数，即归零。荧光阴性对照实际为没有特异性的、与抗体蛋白亚型一致的动物免疫球蛋白。由于化学键、生物键及分子之间的吸引作用，这些蛋白会与标本中的细胞结合，在流式细胞仪上可检出一定的信号。当荧光特异性抗体与标本结合时，会产生两部分信号：非特异信号（即同阴性对照的信号），和特异性结合信号。所以我们只认为大于阴性对照的信号才是由特异结合而引起的信号并将其归入统计范围。
B： FITC
12
13图1-2-17 未调补偿的双参数直方图
上图为未调补偿的双参数直方图。如在理想情况下（没有荧光干扰），因为检测管中只含有PE 标记的IgG 阴性对照（如同A 管一样），所以仍将没有何任信号出现。但实际情况并不如此，在PE 坐标上出现了阳性信号。这个信号就是由于FITC 荧光漏入PE 探测器中而引起的。此时就要取一合适百分比与FITC 信号相乘后去抵消PE 中的信号。（此时电压已通过阴性对照设定，绝对不可变动！）
通过调节补偿参数如下图：
图1-2-18 A 管FITC 荧光信号补偿的调节
打个比方，通过A 管已将FITC 、PE 的荧光信号设为零；此时检测FITC 标记抗体与PE 阴性对照，FITC 信号假设为1000，漏入PE 的信号为200。在补偿调节1号位时，补偿数字为5%，通过计算得出PE 信号：200-1000x5%=150；此时1号位的补偿不足。同理2号位的补为15%，此时PE 信号为：200-1000x15%=50；补偿仍显不足。3号位的补偿为20%，PE 信号为：200-1000x20%=0，补偿调节良好。4号位补偿为30%，PE 信号为：200-1000x30%=-10，此时补偿调节过头，PE 的信号会比原来的本底还低。补偿调节不足或过头都会造成不准确的结果，所以要避免以上两种情况的出现。
当将FITC 漏入PE 的信号恰好全部减除时，即PE 信号与原来本底相同时，此时的补偿便是正确的；即FITC 单阳性细胞的PE 的平均荧光强度与双阴性细胞PE 荧光强度一致。
图1-2-19 FITC/PE 双阴和FITC 单阳荧光示意图
对于FITC 阳性细胞，通过调节补偿需将PE 中的信号恢复至与其本底一至。由上图可知，调节荧光补偿首先要知道双阴性细胞的情况；即通过A 管调节电压确定阴性范围。其次，在检测FITC 标记管中，必须存在阳性细胞和阴性细胞；只有这样才能有本底参照将
PE
14的信号降至与本底一至而不会过多或过少地调节补偿。
同理，如检测C 管：FITC 阴性对照/PE 标记抗体，可将PE 漏入FITC 中荧光去除。但前提条件是在C 管中要存在FITC/PE 双阴性细胞和PE 单阳性细胞。
图1-2-20 FITC/PE 双阴和PE 单阳荧光示意图
在流式细胞上，当PE 单阳性细胞的FITC 平均荧光强度与双阴性细胞的FITC 平均荧光强度一致时，补偿便调节完毕。
在做多色分析时，必须做荧光之间的补偿。方法如上，先准备各种标记的荧光阴性对照，调节确定合适的放大电压。逐管加入各种荧光标记的特异性抗体与其他荧光的对照，然后调节特异性荧光对每个荧光的补偿。
在日常工作中，我们可以用CD4/CD8，或CD3/CD4/CD8多色抗体来调节荧光补偿。现将其原理及方法解释如下。
在人外周血中，存在有T 、B 、NK 等白细胞。当加入CD3-PE-Cy5/CD4-FITC/CD8-PE 三色荧光抗体时，会出现以下几种情况：
CD3-/CD4-/CD8-细胞群：如B 细胞
CD3+/CD4-/CD8-细胞群：如NK 细胞
CD3+/CD4+/CD8-细胞群：如辅助型T 细胞
CD3+/CD4-/CD8+细胞群：如杀伤型T 细胞
由此可知，无论对于哪一个荧光参数都存在阴性细胞群及单阳性细胞群；这就满足了调节补偿的基本要求。已知不存在CD3-/CD4+和CD3-/CD8+阳性细胞，又已知PE-Cy5对于PE 和FITC 的干扰很小，所以不用考虑CD3-PE-Cy5荧光对CD4-FITC 、CD8-PE 荧光的干扰（不会有假阳性存在）。补偿调节如下：
图1-2-21 CD3-PE-CY5、CD4-FITC 和CD8-PE 荧光相互干扰的补偿
在许多实验中，会用到某一标记物进行设”门”情况。此时最终观察的单参数结果而非双参数，所以往往会忽略其中补偿的问题。在这种情况下调节补偿的方法又略有不同，只要清楚地理解补偿的形成及调节原理，便能解决问题。详细的方法见有关章节涉及设”门”的实验方案。
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第二章流式细胞术样品制备及分析技术
第1节样本单细胞悬液的制备方法
一、新鲜实体组织样本的制备
FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。现在已有专门的样本制备仪（见图2-1-1），但有些标本仍需要人工进行细胞分散。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
图2-1-1 流式细胞术自动细胞分离器（BD，Medmachine）
（一） 酶消化法
1、作用原理：
对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。
2、注意事项：
①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的pH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。
3、方法学程序
（1）将适合于酶消化的组织置于离心管中；
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（2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；
（3）一般消化20-30 min（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打；
（4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速离心除去细胞碎片；
（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。
（二）机械法
机械法分散实体组织，用手术剪刀剪碎组织、用锋利的解剖刀剁碎组织或用匀浆器制成组织匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。1、剪碎法：
（1）将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；
（2）用剪刀将组织剪至匀浆状；
（3）加入10ml生理盐水；
（4）用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；
（5）离心沉淀1000 rpm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800 rpm）短时离心沉淀去除细胞碎片；
