②侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90o方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。
以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。
图1-2-7 流式细胞仪的散射光图
（2）荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量(图1-2-8)。
图1-2-8 激光的作用原理
前向角散射
激光
激光
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7荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选取染料或单抗所标记的荧光素，必须考虑仪器所配置光源的波长。目前台式机FCM
① 荧光信号的线性测量与对数测量
荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管（PMT ），PMT 将光信号转换成电信号。有些厂家不采用PMT ，而采用线性放大光电转换器，其优点是降低成本提高线性度，但其最大缺点是响应速度慢，造成仪器分析细胞速度降低，最高速度不可能超过3 300个细胞/秒。如果样本流速超过此速度会导致数据损失，因此高档仪器不采用此种方法。电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA 含量、RNA 含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。但在细胞膜表面抗原等的检测时，通常使用对数放大器，如果原来输出是1，当输入增大到原来的十倍时，输出为2；当输入增大到原来的100倍时，输出为 3 等。在免疫样品中，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍。如用线性放大器，将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。
② 荧光信号的面积和宽度
所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA 含量测量时，采用面积(FL2-A)，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA 的含量，当形状差异较大，而DNA 含量相等的两个细胞，得到的荧光脉冲高度是不等的。经过对荧光信号积分后，所得到的信号值就相等。
荧光信号的宽度（如FL2-W ）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G 1期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A ）与G 2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G 2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate ）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W ）要比单个G 2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。
③
光谱重叠的校正
当细胞携带两种荧光素（如PE 和FITC ）受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另一种荧光。但由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定重叠。要克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路，利用标准已知样品或荧光小球，可合理设置荧光信号的补偿值。采用双激光立体光路技术，就是为了减少各种荧光间相互干扰。其原理是在光路上的光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保光源程序间互不干扰。因此可以避免有第1激光（488nm ）激发出的FL1、FL2、FL3和第2 激光（635nm ）激发出的FL4间的补偿。当然，FL1、FL2和FL3是来自同一点光源，它们之间的补偿是不可避免的。
5、FCM 测量数据的存贮、显示和分析
目前FCM 数据的存贮的方式均采用列表排队（list mode ）方式。因为目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000个细胞，所占容量为4×10000个（字或双字）。同时当只检测1个参数时（如DNA ），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4的空间。数据文件虽然有易于加工处理分析的优点，但缺乏直观性。数据的显示通常有一维直
8方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。
（1）单参数直方图：
细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布，以分布直方图（distribution histogram ）来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值。其单位是道数，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数，见图1-2-9。
图1-2-9 DNA 含量直方图和抗原表达直方图
左图较低道数处细胞峰为G 1期细胞，道数为G 1期细胞两倍的是G 2M 期细胞，二者之间是S 期细胞。右图100-101（M1）为阴性细胞，而101以上（M2）为阳性细胞。
（2）双参数数据的显示
双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量的关系，常用的表达方法有二维点图（dot plot ）,等高线图（contour plot ）,二维密度图（density plot ）。在二维图中，X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。在左下图为FSC 和SSC 组成的点图，从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞区分开，从而可以分别分析各细胞亚群的统计数据。右下图是通过设‘门’分析（gating analysis ）得到的FL1和FL2散点图，设‘门’可以是单参数设‘门’，也可以是双参数设‘门’，通过设”门”可以调出其它参数的相关信息，被调出的信息同样也可以是单参数和双参数。图1-2-10(左)就是通过细胞的前向角和侧向角散射光双参数点阵图，设”门”圈出标本中的淋巴细胞群体，再调出免疫荧光的散点图图1-2-10（右）。
散射光图 双色标记荧光图
图1-2-10 双参数免疫荧光点阵图
（二）流式细胞仪的主要技术指标
1、荧光测量灵敏度：灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标，一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，一般现在FCM均可达到600个荧光分子。
2、仪器的分辨率：分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV（coeffeient of variation）值来表示：
CV=d/m×100%(d-是分布的标准误差，m-是分布的平均值)
如果一群含量完全相等样本，用FCM来测量，理想的情况下，CV=0，用FCM测量曲线表示为图1-2-11（左），但是在整个系统测量中，会带入许多误差，其中样本含量本身的误差，样本在进入流动室时照射光的微弱变化，再加上仪器本身的误差等，实际得到的曲线为图1-2-11（右）。
图1-2-11 仪器分辨率的显示—CV值
CV值越小则曲线分布越窄越集中，测量误差就越小。一般的FCM在最佳状态时CV 值<2%。CD值的计算，除采用以上计算公式外，还可以用半高峰宽来计算。半高峰宽指在峰高一半的地方量得的峰宽，m代表峰顶部的荧光道数；它们与CV值的的关系式如下：
CV=半高峰宽/m×0.4236×100%
上述公式是建立在正态分布条件下，而实际情况所得测量数据分布常常是非对称图形，故采用半高峰宽所计算得到的CV值要明显小于前公式得到的CV值，这在实际工作中应引起注意。
3、前向角散射光检测灵敏度：前向角散射光检测灵敏度是指能够测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.2-0.5μm左右。
4、FCM分析速度：分析速度以每秒可分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超过FCM仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会被丢失，这段时间称为仪器的死时间（dead time）。死时间越短，我们说这台仪器处理数据越快，一般可达3 000个/s-6 000个/s，大型机已达每秒几万个细胞。
5、FCM分选指标：分选指标主要包括：分选速度、分选纯度及分选收获率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数，目前台式带分选的仪器，它的分选速度为300个/s，大型机的FCM最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度是指被分选出的细胞所占的百分比，一般台式机和大型机的分选纯度均可达到99%。分选收获率是指被分选出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下，分选纯度和收获率是互相矛盾的，纯度提高，收获率降低；反之亦然。这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序的排着队，而是随机的。因此，一旦两个不同细胞挨得很近时，在强调纯度和收获率不同的条件下，仪器会作出取或舍的决定。因此，选择不同模式要视具体实验要求而定。图1-2-12为两种细胞分选原理示
意图。
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图1-2-12 细胞分选示意图
（左：通道式分选； 右：电荷式分选）
(三) 流式细胞仪补偿设置
众所周知，流式细胞是通过内置的激光器发射的激光激发荧光染料，通过荧光将488nm 或其他波长的光转变为另一波长的光；并通过光电倍增管将光信号转变为电信号，并由计算机统计处理变为可读数据。
现在流式细胞上常用的荧光素有：
激发波长 发射波长
FITC 488nm 525nm
PE 488nm 575nm
PE-TR 488nm 615nm
PE-Cy5.5 488nm 667nm
PE-Cy7 488nm 767nm
（以上五种荧光染料可在Coulter XL 或BD Calibur 或Partec,PAS,Cyflow ，Cytomation,Moflo 机型上使用）
APC 633nm 660nm
