学研究所） 课题负责人:鞠振宇
学术骨干: 韩忠朝，郑以州，孟爱民
课题三：HSC发育的调控机制 研究目标：
通过ENU化学诱变和全胚胎原位技术在全基因组规模筛选影响HSC增殖，迁移和自我更新的斑马鱼突变家系，并对相关家系进行定位克隆，识别2-6个参与HSC发育的关键“节点”基因，联合小鼠模式生物阐明候选基因在小鼠胚胎HSC发生中的调控作用及机理；发掘小鼠胚内HSC发育的新位点，阐明血液血管干细胞产生HSC的潜能，并获得提高胚胎期HSC富集效率的表面分子新组合；通过制备1-2种组成型和诱导型在特定内皮细胞群体中表达Cre重组酶的转基因小鼠，阐明不同解剖位点对成体造血的生理性贡献；阐明TGF-β/Smads、p53通路、CKI对胚胎AGM区定向造血（尤其是HSC）的调控作用及机制。 研究内容：
1、调控HSC发生的功能基因的基础筛选
（1）利用斑马鱼模型发掘HSC发生的新型调控分子
1)基于前期工作中已通过Runx1和c-myb基因探针原位杂交证实的造血干细胞突变家系，逐步利用多态性markers，将候选疾病基因定位于1/2000，即0.05个cM分辨率内。
2)克隆该候选基因并测序证实突变的存在，初步评估其对蛋白质结构和功能的影响（如移码突变）；而后经过基因敲减和Rescue技术证实该突变基因为候选基因。
3)已克隆的基因有三种情况：a）已知基因和已知功能（参与的信号转导路径已知）；b）已知基因但未知功能；c）未知基因和未知功能。第一种情况将已知的信号转导路径和造血干细胞迁移或自我更新表型相连。第二，三种情况需要对被克隆的基因进行功能和生化机制分析。
（2）基于小鼠Flk-1启动子/增强子活性的HSC调节基因筛选
构建Flk-1 p/e GFP报告载体，制备转基因小鼠，分选AGM区PECAM-1+GFP
－
（生血内皮）和PECAM-1+GFP+（非生血内皮）细胞，进行功能基因组生物芯
片比较分析；或者制备稳定转染Flk-1 p/e GFP的内皮细胞系（无生血功能），通过cDNA表达文库和RNAi文库转染获得GFP－细胞克隆（候选的生血内皮细胞）；即可通过上述2种方法获得候选的调节基因。 2、小鼠HSC发生的基本特征和体内示踪 （1）HSC的发育位点、起源模式和表面标志 1）小鼠胚内（E8.5-E10.5）造血位点的全面分析
应用新生小鼠及改进的成体小鼠HSC移植模型、T/B淋巴细胞体外诱导分化系统等方法综合分析胚内（除p-Sp/AGM区外）的造血活性；通过体外器官培养、Ncx-1基因敲除小鼠（胚胎无血液循环）进一步明确其造血潜能是否原位发生？
2）小鼠AGM区血液血管干细胞的HSC潜能分析
在前期工作基础上，进一步明确AGM区血液血管干细胞（BL-CFC）的表面分子特征，候选分子包括SLAM（CD150/CD48）、Flt3、CD41、ESAM等；结合上述结果，流式多参数分选小鼠E10.5胚胎AGM区（如：Flk-1+CD34+c-Kit+）单细胞单孔接种于双潜能分化体系，之后收集分化细胞分别作血管和HSC功能分析，以明确血液血管干细胞可否是HSC的前体。 3）小鼠AGM区HSC的新的表面分子的发掘
通过分选获得AGM区E10.5的Tie2+c-Kit+（具有生血功能的内皮细胞）和Tie2+c-Kit-（缺乏生血功能的内皮细胞），通过生物芯片分析获得差异表达基因（以表面分子为主）；上述筛选的候选分子与已知标志结合，进一步分选以提高AGM区HSC的富集效率；检测上述分子是否适用于卵黄囊、胎盘、胎肝、骨髓等造血组织HSC的甄别。
（2）利用模式小鼠示踪HSC的体内发生规律
采用胚胎发育中仅在特定内皮细胞群体中表达的分子如Endomucin（除了胚胎体的血管内皮，仅表达于卵黄囊的部分内皮细胞）和EphB4（静脉内皮特异表达）的启动子，构建组成型或可诱导型的在特定内皮细胞中表达Cre重组酶的转基因小鼠，进一步实现谱系示踪，了解这些特定的内皮群体生理条件下对HSC的贡献，丰富和完善对生血内皮特征的认识；之后，结合已有的条件基因
敲除小鼠模型，研究在内皮细胞中剔除TGF-β/Smads通路中信号分子（如TGF-β receptor type 2, Smad4）、P53相关分子、多种CKI等的小鼠其生血内皮的数量、功能以及定向造血发育是否异常，并进一步探索可能的分子调节机制。 3、系统研究候选新基因对小鼠HSC发生的调节功能
应用已有的基因敲除或过表达的小鼠模型，通过血液血管干细胞定量、生血内皮功能及体内重建造血实验、竞争移植实验等方法探讨Puma、iASPP等p53通路相关基因及p18等细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂（CKI）对胚胎AGM区定向造血（尤其是HSC的数目和功能）的调控作用及机制。
选取前述斑马鱼及小鼠模型筛选获得的若干候选基因，制备基因过表达和敲减载体，分别感染小鼠胚胎干细胞和胚胎AGM区细胞，通过分析造血相关基因表达、血液血管干细胞数量及功能、生血内皮数量及功能、HSC数量及功能等指标以评价该基因在小鼠胚胎造血发育中的意义；若需要，可制备基因敲除小鼠作更详细分析。 经费比例: 24%
承担单位: 军事医学科学院、中国科学院上海生命科学研究院 课题负责人: 刘兵
学术骨干: 刘廷析、邓敏、兰雨
课题四：iPS细胞为基础的HSC再生新策略 研究目标:
1、从不同衰老程度的脐带血HSC、中年人骨髓或外周血造血干HSC、老年人骨髓或外周血HSC诱导获得iPS细胞，并定向诱导其向造血细胞分化，通过比较不同细胞来源iPS细胞生成能力以及iPS细胞定向分化能力等差别，确定不同衰老程度的HSC与iPS细胞生成的关系及探讨可能的机制；
2、对iPS细胞向HSC尤其是红系祖细胞定向分化的机制进行探讨，侧重研究微环境中的信号分子对iPS细胞向HSC尤其是红系祖细胞分化的影响，分析其可能的调控机制。
3、进一步优化iPS细胞向HSC尤其是红系祖细定向分化的条件，为全面推动iPS细胞来源的HSC或红系祖细胞走向临床应用奠定基础。 研究内容
从不同年龄段的人外周血或骨髓中获得HSC，诱导获得iPS细胞，探讨不同年龄的人HSC形成iPS细胞的能力；并在此研究基础上定向诱导iPS细胞向造血细胞分化，比较不同HSC来源的iPS细胞再生造血系统的能力；与此同时，结合课题其它几个部分的研究结果，分析p53、p16等遗传学因素和DNA甲基化等表观遗传学因素在iPS细胞生成和分化中的作用和调控机制。进一步优化iPS细胞向造血细胞分化的条件，为以iPS细胞为起始细胞的HSC再生打下基础。
具体研究内容包括三个部分：
1、建立不同年龄段人HSC来源的iPS细胞系，分析其生成iPS细胞能力是否有差别
分选获得不同年龄段（新生儿的脐带血、20-30岁人骨髓或外周血、60-70岁人骨髓或外周血）人HSC，并利用SCF等细胞因子进行培养、扩增，结合前几个部分的研究内容，分析不同来源的HSC中p53,p16通路中关键因子表达以及DNA甲基化等表达遗传学特征。
诱导HSC形成iPS细胞，通过碱磷酶染色、实时定量PCR、Western Blot、基因芯片等方法检测这些细胞的重编程的效率、全能性相关基因及蛋白的表达情况，体内外分化实验检测iPS细胞是否具有分化的全能性。观察不同来源细胞所形成iPS细胞的能力是否有差异。分析p16、p53等衰老相关基因以及DAN甲基化等表观遗传学因素在HSC形成iPS细胞的过程中可能的作用。
与此同时，结合第二部分的研究工作，研究不同年龄阶段的端粒酶敲除小鼠或者ATM基因敲除小鼠的鼠尾成纤维细胞（TTFs）在体外诱导生成iPS细胞的效率。
2、 iPS细胞向HSC定向诱导分化
首先在无血清培养体系下利用细胞因子组合诱导iPS细胞向HSC/HPC的诱导，然后对诱导获得的造血干/祖细胞进行分选富集与鉴定，并在此基础上特异性诱导造血干/祖细胞定向分化为红系细胞，对诱导分化的红系细胞的表型和功能进行检测。在上述诱导分化模型建立的基础上比较不同衰老程度的HSC诱导生成的iPS细胞向HSC及红细胞分化的效率。 3、iPS细胞形成与向HSC定向分化的机制研究
结合课题其它几个部分的研究结果，探讨p53、p16等遗传学因素和DNA甲
基化等表观遗传学因素在iPS细胞生成和分化中的作用和调控机制，并筛选鉴定不同衰老程度的HSC中可能影响iPS细胞生成和分化的因素并明确其作用；与此同时研究Wnt3a、PGE2等关键信号分子对ES/iPS细胞向HSC定向分化的影响，分析其可能调节的信号通路。 经费比例: 22%
承担单位:军事医学科学院，北京生命科学研究所，北京大学 课题负责人: 岳文
学术骨干: 高绍荣 时艳 李艳华
