病毒及基因治疗实验室操作指南
（分子生物学部分）
菌种保存
700μl 菌液加入等体积60%甘油，－20℃或-70℃保存。 甘油菌复苏、培养
方法一:挑取甘油菌一环，接种在含有相应浓度抗生素的LB固体培养基上（活化菌种），
37℃培养过夜（约12～16小时）。选取单独菌落转接在含有相应抗生素的LB
液体培养基中，37℃振摇过夜（约12～16小时）。
方法二:直接吸取10～20μl 甘油菌，接种在含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇过夜（约12～16小时）。 小规模制备质粒DNA（QIA Miniprep Kit Protocol）
适于从1～5ml 菌液中制备20μg、小于10Kb的高拷贝质粒。 （1） （2） （3） （4）
溶液EB放置于37℃孵箱内，预热；
用Ep管收集菌液，10,000 rpm ，离心1min，弃上清； 加入250μl 溶液P1（含RNase），重悬细菌；
加入250μl 溶液P2，轻轻颠倒4～6次混匀，室温下静止2～3分钟（不可超
过5分钟，以免过度消化）；
（5） 加入350μl溶液N3，迅速颠倒4～6次混匀，1,3000 rpm 离心10分钟； （6） 上清入QIAprep柱，1,3000 rpm离心30～60秒，滤液弃之； （7） 加入500μl 溶液PB洗柱，1,3000rpm 离心30～60秒；
（8） 加入750μl 溶液PE洗柱，1,3000rpm 离心30～60秒，弃滤液，再次离心1分钟，以去除残存的PE；
（9） 换新Ep管，加入37℃预热的溶液EB，37℃孵箱内静置1分钟（若质粒较大
可适当延长时间），1,3000 rpm 离心1分钟，-20℃或-70℃冻存备用。
手工方法小规模制备质粒DNA
（1） 将菌液装于Ep管内，用台式离心机10,000rpm离心1min，回收细菌； （2） 加溶液I 200μ（l溶液I成分：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl pH8.0，10mM
EDTA），振荡，重悬细菌； （3） 加溶液II 200μl（溶液II成分：0.2N NaOH，1%SDS），盖严管盖，颠倒4～
5次，混匀，静置3～4分钟。在PH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细
菌染色体DNA变性，再将PH调至中性，在有高浓度溶液存在的环境下，染色体DNA之间发生交联，形成不溶性网状结构，大部分基因组DNA和蛋白质在去垢剂的作用下形成沉淀）；
1
（4） 加溶液III 200μ（溶液lIII成分：5mM KAc 60ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml），迅速颠倒5～6次，冰浴10分钟，1,3000rpm，离心10分钟，取上清；
（5） 加等体积酚：氯仿：异戊醇（V/V=25:24:1），混匀呈白色悬浊液，1,3000rpm
离心5分钟，取上层水相（注意：切勿将酚相与水相之间的白色物质吸起），移入新管； （6） 加入70%体积的异丙醇（约400μl），1,3000rpm离心10分钟，弃上清； （7） 加入70%酒精1ml，充分混合，漂洗沉淀，1,3000rpm离心1分钟，弃上清； （8） 再次6,000rpm离心1分钟，将残存的酒精吸尽；
（9） 将沉淀干燥至无色透明状，加入预热的EB溶液30～50μl，再加入RNase (工
作浓度20μg/ml)， 37℃孵箱内放置30分钟，-20℃保存备用。
酶切反应
(1)体系构成
a) 反应体系应尽可能的小；
b) 酶切缓冲液为整个反应体系的十分之一，本实验室所用酶多为NEB公司产品，具体的缓冲液选择方案，应参照该公司使用说明；
c) 内切酶用量为反应体系的十至二十分之一（若为双酶切，则两种酶的总量占
总反应体系的十至二十分之一），酶的用量过大可能反而不利于酶切（因为内切酶中含有甘油）； d) DNA总量不宜大于2-3μg，否则在进行琼脂糖凝胶电泳时，会产生拖尾现象； （2）37℃水浴1～2小时（或过夜，以求酶切彻底）； （3）10μl 电泳观察酶切是否完全； （4）65℃水浴15分钟，灭活内切酶； （5）-20℃保存备用。
QIAquick 胶回收试剂盒使用说明
（1） 切胶（尽可能地去除多余的胶），称重； （2） 加入缓冲液QG，300μl/100mg胶，＞2%的胶应加大QG用量至600μl/100mg； （3） 56℃水浴放置10分钟，每2-3分钟摇匀一次，使胶完全溶解，胶完全溶解颜
色为黄色、匀质溶液； （4） 当DNA片段大小为＜500bp或＞4Kb时，应加入异丙醇100μl/100mg胶，以
提高产量，此步不离心。DNA片段在500bp～4Kb时，加入异丙醇并不能提高产量；
（5） 结合：将以上混合物转入QIAquick柱（柱容量750μl），离心 1,3000rpm 1min； （6） 洗柱：加0.75ml缓冲液PE，1,3000rpm离心1分钟（注意：用于盐敏感操作时，如平端连接、直接测序等，加入PE后应静置2～5分钟）； （7） 弃离心液，再次1,3000rpm离心1分钟，以去除残余的乙醇；
（8） 将QIAquick柱置于一新的1.5ml Ep管上，滴30～50μl经预热的缓冲液EB
或水于QIAquick柱滤膜中央，静置1分钟，1,4000rpm离心1分钟，所得片
段直接用于连接或－20℃保存备用。
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连接反应
（1） 体系构成（适用于粘端连接）
a) 总反应体系为20μl；
b) 载体与目的片段摩尔数比为1:3～5；
c) T4 Ligase Buffer 2μl（占总反应体系的1/10）； d) T4 Ligase 1μl（占总反应体系的1/20）； e) 载体用量应为0.1μg左右，不宜过高。
（2） 反应条件：16℃水浴放置12～16小时（过夜）。 （3） 反应产物直接用于转化或～20℃保存备用。
感受态细胞的制备
（1） 甘油菌种10～20μl加入5ml LB液体培养基(无抗生素)中，37℃振摇4～6小时，至菌液呈稍微浑浊状（中对数期）；
（2） 菌液冰浴10分钟，分装至两个Ep管内，4℃ 4,000～6,000 rpm离心3～5分钟，收菌；
（3） 弃上清，轻轻重悬细菌于800μl冰预冷的0.1M CaCl2中，冰浴10分钟，4℃
4,000～6,000 rpm离心3～5分钟，收菌； （4） 再将细菌轻轻重悬于50μl冰预冷的0.1M CaCl2中，冰浴，12～24小时可用。
注意： 若用0.1M CaCl2的10%甘油溶液重悬细菌，则可将该感受态细胞保存
于-80℃深低温冰箱内3～6个月，而转化效率不会有明显的下降。
PCR（聚合酶链反应）
（1） 反应体系共25μl，其中：
a）模板为：菌液3μl、病毒液5μl或抽提的质粒DNA 0.5～1μl；
b）引物各0.5μl； c）dNTP 0.5μl； d）10×Buffer 2.5μl；
e）若Buffer中不含MgCl2，则应加PCR专用的MgCl2溶液1.5μl； f）Taq 酶0.5μl；
g）加入Milli Q 水，补齐至25μl。 （2） PCR参数：
a）95℃ 5 min； b）94℃ 30Sec； c）50℃ 30Sec；
20～35个循环 d）72℃ 90 Sec； e）72℃ 链延伸 10min； f）4℃ 保存
g）降温幅度为0.75℃/Sec。
注意：以上反应条件只适用于一般的PCR，若结果不理想，应适当优化。
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大量制备质粒DNA（传统碱裂解法、PEG8000纯化）
适用于从100～250ml菌液中制备100～250μg高拷贝质粒
（1） 涂板，挑取单克隆菌落，加入LB选择性培养基中，37℃振摇8小时，取适量
菌液（1/500～1/1,000）加入LB选择性培养基中（高拷贝质粒用100～250ml，低拷贝用500ml），37℃ 振摇12～16小时； （2） 收获菌液（用50ml离心管）：4℃ 5,000rpm离心10min，弃上清，再次离心2min
吸除残留的培养液；（注意：次步可将离心沉淀后的菌斑－20℃冻存12～24
小时，留待以后操作）； （3） 以10ml溶液I重悬细菌；
（4） 加10ml溶液II，轻轻旋转，颠倒4～6次（不可过重，以免机械剪切基因组DNA），
室温放置5min（不可超过5min，避免过度消化）；
（5） 加入冰预冷的溶液III 10ml，迅速颠倒4～6次混匀，冰上放置20min，以促进
沉淀形成； （6） 4℃ 1,3000rpm（2,000g以上）离心30min，离心前应再次混匀样品；
（7） 上清入新管，4℃ 1,3000rpm（2,000g以上）再次离心15min，充分去除沉淀； （8） 上清入新管，加入60%体积的异丙醇（室温，以避免增加盐沉淀），混匀，室
温放置10min，4℃ 1,5000rpm离心30min（离心前应于管底作好标记），小心、缓慢地倒出上清，切勿将管底的DNA沉淀一并弃去； （9） 清洗：70%乙醇20ml清洗沉淀物，4℃ 1,5000g离心10min，小心、缓慢地倒
出上清，充分凉干，溶于0.1×TE溶液3ml中； （10） 加入等体积（3ml）冰预冷的5M LiCl溶液，充分混匀，4℃ 10,000rpm 离心10min；
（11） 上清入新管，加入等体积(3ml)异丙醇沉淀，室温条件下，以1,000rpm离心10min,
弃尽上清，以70%酒精清洗后，凉干，溶于0.1×TE溶液500～1,000μl中，分装Ep/500μl；
（12） 加入RNase（20μg/ml)，室温放置30min；
（13） 加入含13%（w/v）PEG8000的1.6M NaCl 溶液500μl，充分混匀，室温静置
20min，4℃ 12,000rpm离心5min，回收沉淀的质粒DNA；
（14） 弃上清，以400μl 0.1×TE溶液溶解质粒DNA，用等体积的酚：氯仿（200μl：
200μl）和氯仿（400μl）各抽提一次，水相入新管（氯仿中加入异戊醇可起
到去除泡沫的作用，有利于防止吸出水相与酚相之间的白色物质）；
（15） 加入1/10体积（40μl）3M的醋酸钾溶液，充分混合，加入2倍体积（800μl）的冰预冷的无水乙醇，冰上放置10min，4℃ 12,000rpm离心5min，回收质粒DNA；
（16） 弃上清，加入4℃预冷的70%酒精200μl，稍加振荡，4℃ 12,000rpm 离心5min，
重复该步骤3次；
（17） 吸除上清，敞开管口，室温凉干； （18） 以适量LoTE(pH8.0)溶解沉淀；
（19） 紫外分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳，酶切鉴定。
注意：每个需弃去上清的步骤都应小心地将其装入另一个新管内，以便于当实验不成功时查找原因及补救。
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病毒DNA-QIAGEN试剂盒抽提指南
（1） 取200μl含病毒的细胞悬液入1.5ml离心管，或107培养细胞以PBS悬浮，
不够200μl时以PBS调节；
（2） 加20μl QIAGEN蛋白酶K(PK)储备液和200μl缓冲液AL，Vortex混匀； （3） 56℃孵育10min；
（4） 4,000rpm短暂离心，去除管壁及管盖上的液体；
（5） 加200μl无水乙醇，Vortex混匀15sec，再次4,000rpm短暂离心，去除管壁
上的液体； （6） 溶液入QIAGEN柱，8,000rpm离心1min；
（7） 弃滤液，加入500μl缓冲液AW1，8,000rpm离心1min； （8） 弃滤液，加入500μl缓冲液AW2，14,000rpm离心3min；
（9） 弃滤液，14,000rpm再次离心1min，弃2ml收集管； （10） 置QIAGEN柱于一洁净的1.5ml Ep管中，于滤膜中央滴加56℃预热的缓冲液AE 50μl，室温条件下静止1min（必要时于56℃热浴5min）； （11） 14,000rpm 离心1min，弃QIAGEN柱。 转 化 （1） 感受态细胞50μl，加入2～5μl连接产物，轻弹Ep管底部混合，冰浴30～
60分钟； （2） 42℃热休克90秒，勿摇动试管，再冰浴2分钟；
（3） 加入LB液体培养基（无抗生素）200μl，37℃温和振摇45～60分钟； （4） 铺相应抗性的LB平板（平板要37℃预热），平放20分钟，37℃倒置培养10～
14小时。 Linker的合成 引物各10μl（25μm）加入PCR管中，混匀，置于PCR仪内，按以下程序进行合成： （1） 96℃变性5min；
（2） 以0.01℃/sec的速度降温至72℃，停留5min； （3） 以0.01℃/sec的速度降温至55℃，停留5min； （4） 以0.01℃/sec的速度降温至4℃，备用。 Linker的酶促磷酸化
反应体系：
合成的非磷酸化Linker 10μl 10×激酶缓冲液 10Mm ATP溶液 T4 PNK 100×BSA溶液 Milli Q H2O
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2.0μl 2.0μl 1.0μl
4.0μl(40μg) 5.0μl
37℃温育1小时，产物可直接用于连接反应。
QIAGEN中样和大样质粒提取试剂盒操作步骤
（1） 取甘油菌10μl，接种于LB含抗生素的选择性液体培养基中。高拷贝质粒接种
于25ml（中样）或100ml（大样）培养基中，低拷贝质粒接种于100ml（中样）或500ml（大样）培养基中，37℃振摇过夜，约12～16小时； （2） 用50ml离心管收集菌液，4℃离心6,000g×15min，弃上清；
（3） 加4ml（中样）或10ml（大样）溶液P1（含RNase）重悬细菌，振荡混匀； （4） 加4ml（中样）或10ml（大样）溶液P2，轻轻颠倒4～6次混匀，室温孵育
5min； （5） 加4ml（中样）或10ml（大样）预冷的溶液P3，迅速轻轻颠倒4～6次混匀，
冰浴15min或20min；
（6） 4℃离心20,000g×30min，将含有质粒DNA的上清移入新管；
（7） 4℃再次离心20,000g×15min，上清移入新管；
（8） 以4ml（中样）或10ml（大样）溶液QBT分别平衡QIAGEN-tip 100或QIAGEN-tip 500柱，让液体自然流尽；
（9） 将含有质粒DNA的上清加入QIAGEN-tip柱中，让液体自然流尽； （10） 以2×10ml（中样）或2×30ml（大样）溶液QC洗柱； （11） 加5ml（中样）或15ml（大样）溶液QF，洗脱质粒DNA；
（12） 加3.5ml（中样）或10.5ml（大样）异丙醇，混匀，沉淀质粒DNA； （13） 4℃离心15,000g×30min，小心移去上清；
（14） 加2ml（中样）或5ml（大样）70%酒精，洗涤质粒DNA；
（15） 4℃离心15,000g×10min，小心移去上清；
（16） 室温干燥5～10min至沉淀透明，加溶液EB或TE pH8.0适量（50～100μl）
溶解质粒DNA，－20℃保存备用。
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